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Lexikon zum Laborbefund

Methodenvalidierung

Quantitative Analysenmethoden mit vorkonfek­tionierten Reagenzien

Die im folgenden beschriebenen Maßnahmen zur Methodenvalidierung gelten für quantitative Methoden und Tests, deren Durchführung so­wohl an einem Analysenautomaten als auch ma­nuell erfolgt. Dabei handelt es sich vorwiegend um Methoden mit vorkonfektionierten Reagen­zien oder Testkits. Für Methoden mit vorkon­fektionierten Reagenzien ist es ausreichend, fol­gende Leistungskenndaten zu überprüfen:

·          Präzision (Interassay)

·          Richtigkeit in zwei verschiedenen Kon­zentrationsbereichen

·          Wird ein bestehendes Verfahren ersetzt, ist zusätzlich ein Methodenvergleich mit der Vorgängermethode durchzuführen

Die Ermittlung der Interassay-Präzision und Richtigkeit erfolgt mit Referenzmaterial an 20 Arbeitstagen. Es soll jeweils eine Kontrollprobe im physiologischen und eine im pathologischen Konzentrationsbereich eingesetzt werden. Die Unpräzision wird als Variationskoeffizient (VK) für den jeweiligen Konzentrationsbereich ange­geben. Die Unrichtigkeit wird als mittlere Un­rich­tig­keit angegeben, indem die Abweichung des für die Interassay-Präzision ermittelten Mit­telwerts vom Zielwert mit folgender Formel be­rechnet wird:

                                              

(Mittelwert-Zielwert) x 100 = D (%)                            Zielwert

Für die Auswertung wird ein Statistikprogramm verwendet.

Bei den Messgrößen, die in der Anlage B1 der RiLiBÄK aufgeführt sind, ist als maximal zuläs­sige Abweichung die Spalte 3 einzuhalten (Be­rechnung nach 15 Werten). Für alle anderen Messgrößen müssen  die LIF (laborinterne Feh­lergrenzen) ermittelt werden, wobei  die Her­stellergrenzen, sowie Literaturangaben oder An­gaben der zuständigen Referenzinstitutionen z.B. aus Ringversuchen mit in Betracht gezogen wer­den müssen. In jedem Fall sind die jeweiligen medizinischen Erfordernisse zu berücksichtigen.

Wird eine bestehende Methode durch eine neue ersetzt, ist mit Hilfe eines Methodenvergleiches festzustellen, inwieweit die mit der neuen Me­thode ermittelten Ergebnisse mit denen der be­stehenden vergleichbar sind. Erforderliche Ände­rungen des Referenzbereiches oder einer anderen diagnostischen Entscheidungsgrenze werden den Einsendern mit Einführung der Methode mitge­teilt. Der Methodenvergleich umfasst die Mes­sung von einer ausreichenden Zahl Patientenpro­ben parallel mit beiden Methoden. Die Konzent­rationen der Proben sollten möglichst über den ganzen Messbereich verteilt sein. Die Ergebnisse sind mittels linearer Regressionsanalyse auszu­werten. Dabei ist die Differenz der Geradenstei­gung zu 1 ein Maß für den relativen Konzentra­tionsunterschied, der Achsenabschnitt ein Maß für den absoluten Unterschied der Ergebnisse untereinander und der Korrelationskoeffizient ein Maß für die Streuung der Werte um die Ge­rade. Zur Überprüfung der neuen Methode wer­den ggf. zusätzliche Laborvergleiche durchge­führt. Die Auswertung erfolgt entsprechend der Beschrei­bung des Methodenvergleichs (s.o.).

Quantitative Methoden mit abgewandelten Test-Kits oder aus eigener Entwicklung

Bei quantitativen, manuellen, komplexen Analy­senmethoden wie z.B. HPLC-oder AAS-Verfah­ren sind die oben aufgeführten Leistungskenn­daten in jedem Fall um die Überprüfung der Li­nearität, ggf. der Wiederfindungsrate und der analytischen Bestimmungsgrenze (funktionelle Sensitivität) z.B. DINTEST (EXCEL-Applikation zur Berechnung der linearen Re­gression) zu ergänzen. Die Li­nearität wird in der Regel mit Kalibratoren mit mindestens 5 Messpunkten überprüft, wobei der Messbereich mindestens den Referenzbereich des Analyten umfassen sollte.

Für Methoden, die mit der ICP-MS oder AAS durchgeführt werden, sind folgende Leistungs­daten zu ermit­teln:

Präzision und Richtigkeit mit Hilfe von zwei unterschiedlichen Referenzmaterialien an min­destens zehn Tagen

Linearität mit Hilfe von Standards auf der Basis von mindestens 5 Messpunkten. Sie dient zur Feststellung der Fähigkeit einer Analysenme­thode, Messergebnisse zu liefern, die innerhalb eines gegebenen Bereiches proportional zur Sub­stanzkonzentration sind. Die Linearität wird al­ternativ durch Messung einer mit Reinsubstanz aufdotierten Probe oder durch Verdünnen von konzentrierten Proben bestimmt

Bestimmungsgrenze oder Nachweisgrenze mit Hilfe des Kalibrationsverfahrens bzw. DINTEST

Für die Auswertung wird ein Statistikprogramm verwendet. Die maximal zulässigen Grenzen für die biologischen Materialien entsprechen denen derer für die Qualitätskontrolle.

Wiederfindungsraten werden aus einer repräsentativen Matrix ermittelt, indem eine Pro­be mit Kalib­rierlösungen in zwei unterschied­lichen Konzent­rationen aufgestockt wird. Um Matrixeffekte auszuschließen, ist dabei zu berücksichtigen, dass zum Aufstocken hoch konzentrierte Lösun­gen verwendet werden, so dass nicht mehr als 10 % des Probenvolumens zum Aufstocken ein­gesetzt werden müssen. Dies ist in voneinander unabhängigen Messreihen zu kontrollieren und auszuwerten. Die Wieder­findungsrate soll im Bereich von 80-120% liegen (Mittelwert aus den Bestimmungen).

Bei den Messgrößen, die in der Anlage B1 der RiLiBÄK aufgeführt sind, ist als maximal zuläs­sige Abweichung die Spalte 3 einzuhalten (Be­rechnung nach 15 Werten). Für alle anderen Messgrößen müssen  die LIF (laborinterne Feh­lergrenzen) ermittelt werden, wobei die Her­stel­ler­grenzen, sowie Literaturangaben oder An­gaben der zuständigen Referenzinstitutionen z.B. aus Ringversuchen mit in Beracht gezogen wer­den müssen. In jedem Fall sind die jeweiligen medizinischen Erfordernisse zu berücksichtigen.

Die Stabilität des Analyten ist - wenn keine Lite­raturangabe verfügbar -  bei 2 – 8 °C bzw. bei - 20°C in geeigneten Zeiträumen zu ermitteln. Die Abweichung sollte in der Regel niedriger sein als die Abweichung des Einzelwertes zum Mittel­wert (Spalte 3) der Methode. Der Laborlei­ter kann in medizinisch begründeten Fällen an­dere Grenzwerte festlegen.

Qualitative Methoden mit vorgefertigten Rea­genzien, qualitative Methoden mit abge­wan­delten Test-Kits oder Methoden aus eigener Ent­wicklung

Auch qualitative Methoden dürfen nur dann für die Routine-Analytik freigegeben werden, wenn sie validiert sind. Die folgenden Leistungskenn­daten sind zu überprüfen:

·          Reproduzierbarkeit

·          Sensivität und Spezifität

·          Vergleich mit Tests anderer Hersteller oder mit anderen Analysentechniken

Die Reproduzierbarkeit ist mit einem geeigneten Referenzmaterial an zehn Arbeitstagen zu über­prüfen, bei Inhouse Tests ggf. zusätzlich eine Prüfung auf Kreuzreaktivität mittels Seren die ein möglicherweise kreuzreagierendes Antigen enthalten.

Die diagnostische Sensitivität und Spezifität wird mit der anderen Methode verglichen. Dabei werden mehrere Proben, die mit der anderen Methode ein positives Testergebnis ergaben, und mehrere Proben mit negativem Testergebnis ver­glichen.

Ein Methodenvergleich ist durchzuführen, wenn eine Methode gewechselt wird, z.B. bei einem Wechsel des Analysengeräts; beide Verfah­ren sind anhand von mehreren Patientenproben zu vergleichen. Dabei sollten sowohl negative als auch positive Proben gemessen werden.

Qualitative Methoden in der  Infektionsserologie (ELISA, PCR, u.a.)

1. Tag: positive, negative und grenzwertige Pro­be in Dreifachbestimmung

2. und 3. Tag: positive, negative und grenzwer­ti­ge Probe (gleiche Probe wie vom 1. Tag) in Einfachbestimmung

Innerhalb der Serie und in Bezug auf verschie­dene Arbeitstage müssen die Abweichungen be­züglich der Richtigkeit und Präzision beurteilt werden.

Bei vorkonfektionierten Blots mit rekom­binanten Antigenen ist die Reproduzierbarkeit durch Be­stimmung von einer negativen und einer schwach positiven Probe an drei aufeinan­der fol­genden Tagen zu überprüfen. Bei Blots mit elek­trophoretisch aufgetrennten Antigenen sollte die Überprüfung der Reproduzierbarkeit mit Re­ferenzmaterial (negativ, schwach positiv und po­sitiv) an mindestens drei aufeinander folgenden Tagen erfolgen.

Quantitative Methoden in der Infektionssero­logie:

1. Tag: eine positive, eine negative, eine grenzwertige  und eine stark positive Probe in Dreifachbestimmung

2. und 3. Tag: eine positive, eine negative, eine grenzwertige und eine stark positive Probe (glei­che Probe wie vom 1. Tag) in Einfachbestim­mung

Innerhalb der Serie und in Bezug auf verschie­dene Arbeitstage müssen die Abweichungen be­züglich der Richtigkeit und Präzision beurteilt werden. Ggf. müssen in Abhängigkeit der Be­deutung des Tests weitere Kenndaten überprüft werden.

Zelluläre Analysemethoden und Funktionsunter­suchungen von Zellen

Die Analyse des automatisierten Differential­blutbildes wird als quantitative Analyse mit vor­konfektionierten Reagenzien betrachtet. Die Präzision und Richtigkeit wird an 20 Tagen mit Hilfe einer normalen, abnormalen (niedrig) und einer abnormalen (hoch) Referenzkontrolle be­stimmt. Bis auf das kleine Blutbild sind alle Pa­rameter aus diesem Bereich nicht in der Anlage 1 der RiliBÄK enthalten.

Als vorkonfektionierter Testkit wird bei der Lymphozyten-Immunphänotypisierung die Prä­zi­­­­­sion und Richtigkeit an 20 aufeinander fol­genden Tagen mit Hilfe einer normalen und abnormalen Referenzkontrolle (kommerziell erhältliches sta­bilisiertes Kontrollmaterial, z.B. CD-Chex) be­stimmt.

Morphologische Untersuchungen von Körper­flüssigkeiten

Eine Besonderheit bei der Validierung stellt die morphologische Diagnostik von Ausstrichen des peripheren Blutes am Mikroskop dar, deren Vali­dierung und Qualität nur durch Erfahrung und regelmäßige Fortbildungen von den im Be­reich tätigen MTAs und Ärzten sowie durch Teil­nahme an Ringversuchen zu sichern ist. Auch hier werden die Ergebnisse der Morpho­logie mit denen der Immunphänotypisierung und der übri­gen Laborwerte (z.B. Blutbild, LDH etc.) im Sinne einer Plausibilitätsprüfung durch den be­fundenden Arzt verglichen.

Molekularbiologische Methoden mit vorkon­fektio­nierte Testkits

Zur Überprüfung der Re­produzierbarkeit  von Mutationsnachweisen sollte ein positives und ein ne­gatives Kontrollmaterial, z.B. Patienten-DNA mit nachgewiesener Mutation oder kommerziell erhältliches Kontrollmaterial sowie ein Wildtyp, an mehreren Arbeitstagen gemessen werden. Die Richtigkeit der Bestimmungen wird durch La­bor-Vergleich (Zwei Proben mit Mutation, eine Probe mit Wildtyp) oder Ringversuch überprüft.

Die Präzision und Richtigkeit qualitativer und quantitativer Nachweise von RNA/DNA vira­ler/bakterieller Herkunft wird mit Hilfe von geeignetem Kontrollmaterial (z.B. WHO-Refe­renzstandard, Ringversuchsproben) ermittelt.

Bei In-Haus-Methoden zur qualitativen und quantitative Be­stimmung viraler/bakterieller RNA/DNA wird die Präzision und Richtigkeit mit Hilfe ge­eignetem Kontrollmaterial (z.B. WHO-Referenz­standard, Ringversuchsproben) überprüft.

Zur Ermittlung der Sensitivität wird eine Ver­dünnungsreihe mit Referenzmaterial oder gespiktem Nativmaterial bis zur Nachweisgrenze erstellt. Die Primer- und Sonden-Spezifität ist halbjährlich über eine Sequenzvergleichsanalyse auf eventuelle Homologien hin zu überprüfen (BLAST = Basic Local Alignment Search Tool). Die Validierung der Spezifität erfolgt mit mehre­ren Erreger-negativen Proben

Jede Validierung jeder quantitativen oder quali­tativen Methode wird durch die Teilnahme an einem Ringversuch, wenn zugänglich, ansonsten durch einen Vergleich mit einem Referenzlabor, abge­schlossen.


Dr. Stephan Schauseil et. al., Medizinische Laboratorien Düsseldorf


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